為了規(guī)范酶聯(lián)免疫診斷試劑的生產(chǎn)和質(zhì)量控制，制定本技術(shù)指導(dǎo)原則。

    本指導(dǎo)原則適用于應(yīng)用酶聯(lián)免疫法的第三類診斷試劑（病原微生物）的生產(chǎn)和質(zhì)量控制，其他類酶聯(lián)免疫診斷試劑參考本指導(dǎo)原則。國家藥品監(jiān)督管理部門將依據(jù)科學(xué)技術(shù)發(fā)展的需要，適時組織修訂。

一、基本原則

（一）酶聯(lián)免疫診斷試劑生產(chǎn)用的各種原料、輔料應(yīng)當(dāng)制定其相應(yīng)的質(zhì)量指標(biāo)，并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求。

（二）酶聯(lián)免疫診斷試劑的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具備相應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員、儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境，獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》；同時，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實施細則（試行）》的要求建立相應(yīng)的質(zhì)量管理體系，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運行；生產(chǎn)企業(yè)還應(yīng)該通過《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》的考核。

（三）酶聯(lián)免疫診斷試劑在研制時，應(yīng)當(dāng)遵循科學(xué)、規(guī)范的原則，各反應(yīng)條件的選擇和確定應(yīng)符合基本的科學(xué)原理。

（四）酶聯(lián)免疫診斷試劑生產(chǎn)過程中所用的各種材料及工藝，應(yīng)充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

（五）生產(chǎn)和質(zhì)量控制的總體目標(biāo)：保證試劑使用安全、質(zhì)量穩(wěn)定、工藝可控、檢測有效。

二、原材料質(zhì)量控制

（一）主要生物原料

與診斷試劑的質(zhì)量zui密切相關(guān)的生物原料主要包括各種生物活性抗原、重組抗原、單克隆杭體、多克隆抗體以及多肽類、激素類等生物原科。這類原料可用于包被酶標(biāo)反應(yīng)板、標(biāo)記相關(guān)酶（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應(yīng)用抗原或抗體、制備校準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品）等。一般應(yīng)按照工藝要求對這類生物原料進行質(zhì)量檢驗，以保證其達到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。主要生物原料若為企業(yè)自己生產(chǎn)，其工藝必須相對穩(wěn)定；若購買，其供應(yīng)商要求相對固定，不能隨意變更供應(yīng)商，如果主要原料（包括工藝）或其供應(yīng)商有變更，必須進行原料驗證，并進行補充申報。

主要生物原料的常規(guī)檢驗項目一般包括：

1、外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清透明的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀；或者為白色粉末，不含有其他顏色的雜質(zhì)；特殊生物原料應(yīng)具備相應(yīng)外觀標(biāo)準(zhǔn)。

2、純度和分子量

主要經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進行分析，也可用其他適宜的方法，如液相法等。根據(jù)所檢測生物原料的分子量選擇適宜丙烯酸胺凝膠濃度進行電泳。一般情況下，每個電泳道加樣量為5μg，同時用已知分子量標(biāo)準(zhǔn)作參照，采用合適的電泳電流和電泳時間；電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量。作為診斷試劑用生物原材料，用銀染法染色后，純度一般都要大于90％；用考馬斯亮藍染色后，純度一般都要大于95％。

3、蛋白濃度

蛋白濃度可通過Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲方法等進行檢測；

4、效價

效價的測定一般根據(jù)蛋白含量測定結(jié)果，通過倍比稀釋法進行。效價應(yīng)達到規(guī)定的要求。

5、功能性實驗

功能性實驗是指生物原料用于試劑盒實際生產(chǎn)中的情況，一般考查使用該原料的試劑的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性等，并比較其與上批次原料的相關(guān)性。

（二）生物輔料

生物輔料指的是在生產(chǎn)過程中作為蛋白保護劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料均應(yīng)按照《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（2000年版）》所規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求進行檢驗，達到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后方應(yīng)用于生產(chǎn)。

生物輔料的供應(yīng)商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應(yīng)商。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應(yīng)進行功能性實驗，即以其為原料配制10％濃度的稀釋液作為樣品，進行酶聯(lián)免疫測定，均不得出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。

對于標(biāo)記用酶，應(yīng)在產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明示所使用的標(biāo)記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時應(yīng)根據(jù)不同生產(chǎn)廠家的檢定方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行檢驗，酶的純度RZ值（OD403nm/OD280nm）應(yīng)大于3.0。

（三）化學(xué)原材料

參照《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（2000年版）》分析純級別進行檢驗。主要的檢測指標(biāo)包括：溶液外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值檢測、溶解情況檢測、干燥失重的檢測、熾灼殘渣等。

主要化學(xué)原材料的供應(yīng)商要求相對固定，不得隨意發(fā)生變更。化學(xué)原材料在購入時，原材料的生產(chǎn)商必須提供該批次化學(xué)原材料的質(zhì)量質(zhì)量保證材料和質(zhì)量檢驗報告，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)達到生產(chǎn)所需的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

（四）其他物料

1、酶標(biāo)板

（1）外觀

明亮處用肉眼觀察板條的外觀質(zhì)量。如有欠注、飛邊、骯臟、表面光潔度差，底部有波紋及劃傷等應(yīng)剔除。

（2）吸附能力和精密性

用一定濃度的正常人IgG包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶結(jié)合物吸附，通過顯色反應(yīng)，雙波長酶標(biāo)儀（主波長450nm，參考波長630nm）讀數(shù)。計算CV值，批內(nèi)CV≤5％，批間CV≤10％。

2、液體試劑裝量瓶

包括陰陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分，均應(yīng)有相應(yīng)的裝量瓶，并建立相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，如不同的液體試劑所用的裝量瓶規(guī)格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。

3、其他材料

包括試劑瓶標(biāo)簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，均應(yīng)符合相應(yīng)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，如數(shù)量、規(guī)格等。

（五）企業(yè)質(zhì)控品

企業(yè)質(zhì)控品包括陰陽性參考品的符合率、靈敏度（zui低檢出量）、靈敏度、精密性（均一性）等質(zhì)控樣品，對于定量檢測試劑，還包括線性質(zhì)控品樣品。如該產(chǎn)品具有國家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，應(yīng)使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）進行標(biāo)化；若該診斷試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則企業(yè)參考品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能低于國家藥品監(jiān)督管理部門已經(jīng)批復(fù)的*家試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

企業(yè)質(zhì)控品的基質(zhì)應(yīng)與診斷試劑的待測樣品的基質(zhì)基本一致，如待測樣品為血清/血漿，質(zhì)控品基質(zhì)也應(yīng)為血清/血漿。

三、試劑盒各組分的生產(chǎn)

酶聯(lián)免疫診斷試劑盒主要組分的生產(chǎn)包括酶標(biāo)記物的制備及滴配過程（酶工作液濃度確定）、各種工作溶液的配制、包被酶標(biāo)反應(yīng)板、分裝及包裝等步驟；并通過產(chǎn)品的半成品檢定和成品檢定兩個質(zhì)控過程來完成。

（一）各種工作液的配制

酶聯(lián)免疫診斷試劑研制生產(chǎn)過程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液、陰性陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等，對定量檢測試劑，還包括標(biāo)準(zhǔn)品（或校準(zhǔn)品）溶液。若陰性陽性對照或其他液體組分涉及生物安全性問題，制備時應(yīng)在相應(yīng)的生物安全實驗室完成。

各種工作液在配制過程中應(yīng)嚴(yán)格按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的配方進行配制，充分混勻確保液體中的各種成分均勻，同時進行相應(yīng)的質(zhì)量檢驗并達到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后，方可使用或者分裝。對于定量檢測試劑，其標(biāo)準(zhǔn)品（或校準(zhǔn)品）溶液應(yīng)該在量值上具有溯源性。

應(yīng)對配制過程及配制的液體進行的質(zhì)量控制，主要包括酶結(jié)合物的功能性實驗及穩(wěn)定性；各種溶液的外觀、pH值及電導(dǎo)率的測定等；酶作用的底物應(yīng)測定在無相應(yīng)酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標(biāo)；終止液應(yīng)對其終止酶促反應(yīng)的能力進行測定。

（二）包被酶標(biāo)反應(yīng)板

包被前應(yīng)對酶標(biāo)反應(yīng)板進行質(zhì)量檢驗，如尺寸、外觀、包裝、吸附性能、精密性等，并記錄酶標(biāo)反應(yīng)板的批號、數(shù)目、標(biāo)識。酶標(biāo)反應(yīng)板經(jīng)檢驗合格后方能用于包被。不同批號的板條不能混用。

選擇經(jīng)檢定合格的包被原料（如抗原、抗體等），經(jīng)一定的方法確定*包被濃度和酶結(jié)合物工作濃度，按照診斷試劑的生產(chǎn)規(guī)程，配制包被緩沖液、封閉液，經(jīng)檢驗合格后，包被酶標(biāo)反應(yīng)板，經(jīng)干燥后，已包被的酶標(biāo)反應(yīng)板用鋁箔紙封閉（內(nèi)置干燥劑），抽真空后，保存于2?8℃。

應(yīng)對包被過程進行相應(yīng)的質(zhì)量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質(zhì)量檢驗、包被液和封閉液的質(zhì)控（如配方、外觀、pH）、包被過程的監(jiān)控（包括包被和封閉的體積、溫度、濕度、時間等）、包被均一性檢驗、干燥過程的監(jiān)控等。

（三）分裝和包裝

樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等溶液應(yīng)嚴(yán)格按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的量進行無菌處理后再分裝，分裝量的誤差應(yīng)小于<5%。

分裝及包裝均應(yīng)按照相應(yīng)的SOP的要求進行。包裝前，應(yīng)嚴(yán)格檢查試劑盒的品名、批號等，核對各試劑盒各組分的數(shù)量，并在關(guān)盒前進行復(fù)核。

四、質(zhì)量控制

（一）半成品質(zhì)量控制

1、半成品抽樣

檢驗人員按試劑的批號，根據(jù)抽樣申請單抽取規(guī)定數(shù)量的半成品各組分，作號標(biāo)記、待檢。

2、半成品檢驗

利用上一批檢定合格的試劑盒的相應(yīng)組分，對本批生產(chǎn)出的各種試劑盒組分分別進行檢驗，檢驗結(jié)果達到產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

半成品檢驗，一般使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）或經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）標(biāo)化后的質(zhì)控品。若某類試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則使用企業(yè)參考品，但該企業(yè)參考品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能低于國家藥品監(jiān)督管理部門已經(jīng)批復(fù)的*家試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

檢測所抽樣的半成品的試劑盒性能，包括陰陽性參考品的符合率、靈敏度（zui低檢出量）、精密性等，均應(yīng)達到相應(yīng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求，對精密性，一般情況下CV不得高于15％（采用競爭抑制法的診斷試劑CV不得高于20％）。對定量檢測試劑，同時應(yīng)分析其線性相關(guān)系數(shù)和校準(zhǔn)品檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

企業(yè)應(yīng)該具有對每一批試劑的半成品進行穩(wěn)定性研究。

（二）成品質(zhì)量控制

產(chǎn)品包裝完成后，質(zhì)檢人員根據(jù)試劑的批號、實際包裝量、抽樣申請單的要求進行抽樣，同時填寫抽樣數(shù)量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數(shù)量應(yīng)包括檢定用數(shù)量和留樣數(shù)量。質(zhì)檢人員同時應(yīng)檢查相關(guān)原始記錄。

每一批酶聯(lián)免疫診斷試劑報批批量zui低要求：達到1萬人份/批。

1、檢驗

（1）成品檢驗

一般使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）對成品進行檢驗，并達到質(zhì)控品的質(zhì)量要求。若該診斷試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則使用企業(yè)參考品，但其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能低于國家藥品監(jiān)督管理部門已經(jīng)批復(fù)的*家試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

（2）穩(wěn)定性試驗

在批放行前，每一批酶聯(lián)免疫診斷試劑需具備穩(wěn)定性研究資料。